Зростаюча кількість досліджень показала, що комахи і членистоногі можуть діяти як агенти, що поширюють та пасивно передають патогени потенційним господарям, при цьому самі не схильні до зараження. Наприклад, у ґрунтовому середовищі колемболи можуть сприяти поширенню грибків Beauveria bassiana, несучи конідії, прикріплені до їхнього тіла або розташовані в кишківнику. У медоносних бджіл та джмелів форетні кліщі Варроа були ідентифіковані як поширені переносники вірусів та грибків, що викликають загибель та руйнування бджолиних та джмелиних сімей. Отже, членистоногі-переносники можуть формувати прямі та непрямі взаємодії між патогеном та його господарем і, отже, впливати на динаміку їхньої популяції. Хоча такі взаємодії мають бути звичними за своєю природою, роль членистоногих у процесі рознесення патогенів залишається мало вивченою.
У боротьбі зі шкідниками, як показує практика, використання якогось одного засобу контролю їхньої популяції часто має низьку ефективність. У пошуках нових засобів та методів боротьби з фітофагами постало питання визначення взаємодій між ентоматопатогенами та хижаками, здатність хижаків транспортувати патогени в колонії шкідників, у спробі використовувати комбінації цих двох засобів біологічного контролю шкідників.
Комахи можуть збільшити швидкість, з якою хвороба горизонтально передається сприйнятливим господарям, або через прямий фізичний контакт (наприклад, під час хижацтва або спроби паразитизму), або опосередковано, вивільняючи інфекційні пропагули (спори грибів) у довкілля. У таких випадках, коли існує тісна асоціація між агентом поширення та господарем, чутливим до патогену, зустріч між видами, що взаємодіють, не є випадковою подією. Наприклад, здатність хижака поширювати грибкові конідії Beauveria bassiana на свою здобич буде в першу чергу залежати від того, як конідії видаляються з кутикули (або під час чищення, або при ходьбі) і від його поведінки при пошуку їжі (наприклад, місцезнаходження довкілля, пошукова поведінка з обмеженою областю пошуку), які сприяють збільшенню просторового збігу з жертвою.
Дослідження здатності фітосеїдних кліщів росносити спори ентомопатогенного гриба Beauveria bassiana у місця скупчення трипсів
Beauveria bassiana – ентомопатогенний гриб, який як господаря може використовувати більше 200 видів з більшості загонів комах, при цьому деякі ізоляти демонструють високий ступінь специфічності. Конідії можуть бути рознесені за допомогою руху повітря завдяки мікроскопічним розмірам (1-3 мкм), так і при контакті з інфікованими господарями або через агентів поширення. Конідії прикріплюються до кутикули господаря, проростають, проникають у господаря за допомогою ферментативних та механічних процесів, а потім відтворюються, використовуючи гемолімфу та різні тканини господаря. Як тільки поживні речовини господаря виснажуються, гриб пробиває кутикулу зсередини і утворює велику кількість спор. Комерційні штами B. bassiana використовуються для боротьби зі шкідниками у програмах біологічного захисту (IPM). Їх зазвичай розпорошують на посіви як пестициди. Можливість контакту з господарем залежить від просторового розподілу шкідників.
Західний квітковий трипс (Frankliniella occidentalis) – ціль експериментів
Багатоїдна комаха, яка харчується майже всіма частинами рослин, від листя до квітів і стручків, вона також може переносити ряд рослинних вірусів. Frankliniella occidentalis може ховатися у важкодосяжних частинах рослин, де пестициди не можуть дістатися до них.
Як хижі кліщі, що харчуються трипсами і здатні переносити спори Beauveria bassiana, були обрані Amblyseius cucumeris і Amblyseius swirskii.
Планування експерименту Beauveria bassiana
Матеріал A. cucumeris, що вирощувався на темноногому кліщі (Aleuroglyphus ovatus) як корм, у той час як A. swirskii, вирощувався на кормовій суміші, що містить винного кліща (Carpoglyphus lactis) і пилок вишні. Frankliniella occidentalis був отриманий з лабораторної колонії і вирощений на рослині червоної квасолі (Phaseolus vulgaris) з пилком вишні. Усі колонії витримували при 25 °C, відносній вологості 60-70 % і світловому циклі 14/10 (світло/темрява). Штам Beauveria bassiana ANT-03 був зареєстрований для боротьби з трипсами. Для всіх експериментів був використаний порошок B. bassiana технічної чистоти, що містить 5×1010 КУО/г.

Щоб перевірити здатність хижих кліщів доставляти B. bassiana трипсам, вчені спочатку встановили роздільники рослини на частини, заражені та не заражені трипсами. Щоб стандартизувати структуру рослини, спочатку обрізали квасолю (приблизно 20 см заввишки) до двох трилистків (Мал. 1).
Щоб створити скупчення личинок трипсів на рослині, було вміщено 25 яйцекладних самок трипсів на 24 години в сітчасту затискну клітку на одному листі. Передбачалося, що в період відкладання яєць самки трипса харчувалися і залишали на листі ароматичні відбитки, які можуть використовуватися хижими кліщами для визначення місцезнаходження жертви.
Уникнення помилок в експерименті
Щоб уникнути потенційної експериментальної помилки, пов’язаної з віком або положенням листя, половина рослин мала трипсів на листку 2 (Мал. 1), середній лист більш старого трійчастого листа, в той час як другий набір рослин мав трипсів на листку 5, середній лист молодого трійчастого листа (Мал. 1). Після відкладання яєць з рослини видаляли клітку-затискач і самок трипсів. Через чотири дні, коли більшість яєць перетворилося на личинок першого віку, були випущені хижі кліщі, з нанесеною на них B. bassiana на рослину.
Дорослі самки хижих кліщів різного віку піддавались контакту з конідіями B. bassiana у комерційному субстраті протягом двох годин для отримання максимального навантаження конідій на їхнє тіло (Мал. 2). У модифіковану пробірку Еппендорфа було поміщено 25 хижих кліщів з 0,2 г субстрату, зараженого B. bassiana. Пробірка прикріплювалася до стебла на рівній відстані від основи черешка двох трійчастих листків (Мал. 1).

Деталі експерименту Beauveria bassiana
Щоб контролювати поширення конідій B. bassiana повітрям і можливе механічне порушення під час експериментальних маніпуляцій, до рослини прикріплювали пробірку, що містить 0,2 г субстрату, зараженого B. bassiana (контрольна обробка). Кожна рослина була ізольована у паперовому циліндрі, а внутрішні стінки та дно паперового циліндра були покриті кільцями клею для запобігання поширенню конідій та хижих кліщів між експериментальними одиницями. Для кожного набору рослин (лист 2 проти листа 5) було три обробки: контроль, A. cucumeris, оброблений B. bassiana, і A. swirskii, оброблений B. bassiana. Експеримент повторювали дев’ять разів із двома рослинами на обробку в кожному блоці при 25 °C, відносній вологості 60-70 % та світловому циклі 14/10 (день/ніч). Два блоки, в яких трипси не залишалися на рослинах, були виключені з аналізу частки трипсів, що несуть B. bassiana, оскільки цей параметр неможливо оцінити відсутність трипсів.
Дослідження рослин в ході експериментів
Через 48 годин після випуску кліщів-фітосеїд, рослини були ретельно досліджені, щоб встановити кількість і просторовий розподіл хижаків і жертв, що вижили. Кожну з дев’яти частин рослини (Мал. 1) збирали та поміщали в одну чашу об’ємом 60 мл з кришкою. Чаша була наповнена вуглекислим газом, щоб зупинити рух трипсів та хижих кліщів, полегшити обіг і уникнути перехресного зараження грибками між особинами. Реєстрували кількість живих кліщів та трипсів на кожній частині рослини. Передбачалося, що загибель трипсів є результатом присутності хижаків, оскільки конідії B. bassiana не можуть прорости і проникнути в тканини трипсів протягом 48 годин.

Щоб виявити присутність або відсутність Beauveria bassiana на живих трипсах, які залишалися на рослинах до кінця експерименту, трипси були індивідуально зібрані за допомогою стерилізованої зубочистки або чистої тонкої щітки і поміщені в невелику чашку Петрі (Ø 35 мм), що містить 2,5 мл поживного середовища для B. Bassiana. Чашки Петрі досліджували через 10 днів, коли можна було візуалізувати кількість колонієутворюючих одиниць (КУО). Розраховували частку трипсів, які несли конідії.
Щоб оцінити кількість конідій на кожній частині рослини після видалення комах, листя та стебла розрізали на невеликі шматочки (<2 см завширшки та завдовжки) і поміщали назад у одиночну чашку. Конідії змивали в кожну чашку і чашки поміщали на роторний шейкер на 2 години при швидкості 125 об/хв. Потім одну пробу суспензії 0,5 мл переносили на поживне середовище для B. bassiana і через 9 днів підраховували кількість КУО. Для кожної рослини відзначали суму КУО, доставлених на всю рослину і, конкретніше, кількість і пропорцію КУО на листі, де самки трипсу відкладали яйця.

Дані експериментів
У ході проведених дослідів були отримані такі дані, наведені на малюнках 3-6. Кількість КУО, зібраних з усієї рослини, значно різниться між обробками. Як A. swirskii, так і A. cucumeris сприяли збільшенню загальної кількості КУО на рослинах порівняно з контролем (Мал. 3). Одна рослина з контрольної обробки була виключена з аналізу, оскільки на одному аркуші висадилася надзвичайно велика кількість конідій (19800).
Взаємодія хижих кліщів з конидіями Beauveria bassiana
Було виявлено взаємодію між листом, у якому були відкладені яйця трипсу, та обробкою. Для A. swirskii кількість спор була більшою, коли яйця трипса відкладалися на молодий лист, ніж на старий. Amblyseius swirskii збільшував кількість КУО, виділених з листа, в якому були відкладені яйця трипса, порівняно з контролем та рослинами, на які виселяли A. Cucumeris (Мал. 4).
В ході експерименту було неможливо завантажити два види хижих кліщів з однаковою кількістю конідій. Таким чином оцінювали частку B. bassiana, доставлену до листа, в якому були відкладені яйця трипсів, двома видами хижих кліщів. Частка КУО, витягнутих з листа, в якому були відкладені яйця трипсів, варіювалася між обробками, при цьому A. swirskii збільшував частку B. bassiana на листі для відкладення трипсу в порівнянні з контролем, але не з A. cucumeris. Amblyseius swirskii доставляв значно більшу частку B. bassiana на лист, у якому трипс відкладав яйця, ніж A. cucumeris.

Через сорок вісім годин після випуску хижих кліщів із рослин було вилучено більшу кількість A. swirskii, ніж A. cucumeris. Кількість трипсів, що залишилися на рослинах наприкінці експерименту, також варіювало між обробками (Мал. 5). Amblyseius swirskii сильніше знижував кількість трипсів на рослинах.
Результати проведеного дослідження показують, що A. swirskii та A. cucumeris мають здатність поширювати конідії B. bassiana на рослинах під час харчування. Однак A. swirskii ефективніший, ніж A. cucumeris, оскільки вони доставляють більшу кількість конідій у колонії трипсів.
Способи доставки конідій Beauveria bassiana на рослину
Є два основних способи, якими конідії можуть бути відокремлені від тіла хижого кліща та розпорошені по рослині. Їх можуть або активно прибирати кліщі під час чищення, або стираючи о поверхню рослини, коли хижі кліщі пересуваються. Чищення, за допомогою ніг, спостерігається у фітосеїдних кліщів, коли вони стикаються з потенційно патогенними грибами. Однак чищення неефективне видалення всіх конідій з тіла кліщів, особливо тих, які розташовані на спинних ділянках їх тіла. Також виявлено, що A. swirskii та A. cucumeris в основному видаляли конідії зі свого тіла, ходячи по поверхні рослини. Справді, тривалість ходьби впливає видалення конідій в обох видів. Трихоми та інші структури, пов’язані з поверхнею листя бобів, сприяють видаленню конідій при ходьбі кліщів (мал. 6В). Таким чином, хижі кліщі у пошуках їжі активно поширюють конідії B. bassiana у навколишньому середовищі.

Як можуть передаватися конидії Beauveria bassiana трипсам
За посередництва хижих кліщів передача конідій трипсу може бути пасивним або активним процесом. Конідії вивантажуються на поверхню рослин і можуть згодом пасивно прикріплюватися до кутикули трипсів, коли вони годуються на забрудненому субстраті. В якості альтернативи конідії можуть безпосередньо передаватися від хижих кліщів трипсам під час невдалого випадку хижацтва, що включає фізичний контакт між хижаком і жертвою. Присутність хижих кліщів у безпосередній близькості від колоній трипсів може проводити їх поведінка. Після виявлення хижаків трипси можуть перемикатися з постійного харчування на втечу, тим самим збільшуючи ймовірність контакту зі спорами, розсіяними на рослинах.
Розбіжності, що спостерігаються між A. swirskii і A. cucumeris в їх здатності поширювати конідії B. bassiana в колонії трипсів можуть виникати через відмінності в способах харчування хижаків. Як з’ясовано A. swirskii, пригнічував трипсів сильніше, ніж A. cucumeris в експериментальній установці. Різниця в пропорціях конідій, що доставляють у місця зосередження трипсів двома видами хижих кліщів, свідчить про кращу здатність A. swirskii вражати трипсів на квасоляних рослинах.
Важливість роботи конидій гриба Beauveria bassiana для захисту рослин від трипсів
Швидкість, з якою B. bassiana контактує зі своїм господарем, має вирішальне значення в контексті біологічного контролю не тільки тому, що вона безпосередньо пов’язана зі швидкістю зараження, але й тому, що життєздатність конідій дуже чутлива до умов навколишнього середовища, таких як УФ та вологість . У деяких випадках застосування B. bassiana як самостійного засобу контролю шкідників неефективне для боротьби з цільовими шкідниками. Наприклад, західні квіткові трипси часто ховаються в ущелинах рослин та бутонах. В результаті розпилення патогенних грибків мало впливає рівень зараженості трипсами. У таких обставинах здатність хижих кліщів доставляти хвороботворні мікроорганізми та грибки у колонії трипсів може збільшити передачу хвороби. У проведеному експерименті смертність трипсів після контакту з патогенами не оцінювалася. Тим не менш, було показано, що ЛД50 є відносно низькою для порошку B. bassiana технічної чистоти: приблизно 50 конідій на личинку F. occidentalis 2-го віку і лише 5 на дорослу особину.
Висновки про відносний потенціал A. swirskii та A. cucumeris у поширенні конідій Beauveria bassiana до трипсів
Були зроблені висновки, що в даних експериментальних умовах A. swirskii є найкращим засобом біологічної боротьби, оскільки він сильніше скорочує кількість трипсів і передає конідії більшій кількості трипсів, що рятуються від хижаків. Однак A. cucumeris може продемонструвати добрий потенціал як хижака, так і агента поширення ентомопатогенів при використанні в іншій асоціації сільськогосподарських культур та шкідників. Наприклад, у теплицях з регіонів з помірним кліматом було показано, що A. cucumeris показав такі ж характеристики, як і A. swirskii, як агент біоконтролю трипсів у змодельованих зимових умовах.
Як можна застосувати таку систему у програмі біологічного контролю?
Виробники випускають хижих кліщів та періодично обробляють рослини B. bassiana для боротьби з трипсами. Запропонована вченими стратегія не потребує двох окремих обробок, а потребує лише внесення конідій Beauveria bassiana (технічний порошок) у комерційну упаковку з хижими кліщами. Хижі кліщі збільшать швидкість передачі хвороб скритноживучим шкідникам. Загальний потенціал хижих видів кліщів як агентів поширення патогенів залежатиме від їхньої здатності бути навантаженим конідіями, їхньої здатності протистояти патогенним інфекціям та його активності у пошуках їжі. Хижі кліщі повинні бути тісно пов’язані з цільовим шкідником і мати можливість шукати, виявляти та взаємодіяти зі шкідниками на рослині, щоб вони могли розсіювати спори на рослині та на шкідників.

Автор перекладу: технолог із захисту рослин Компанії «Біо Захист»
Дорошенко Антон
Пошта: dav@bio-group.net
Телефон: +38 63 471 24 81






























